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荧光PCR

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Real Time PCR技术最早报告在1991年,是由日本人Hihuchi提出的。当时他的想法就是想实时观察PCR反应的全过程,最终达到检测样品中的DNA量的目的。他使用了EB(溴乙锭)作为荧光标记染料,利用了PCR反应中的数学函数关系,再结合加入标准品的方法,达到了对检测样品进行准确定量的目的。

1995年美国PE公司成功研制了TaqMan技术,1996年又推出了首台Real Time PCR检测系统,使Real Time PCR技术真正得以应用和推广。近年,Real Time PCR技术不断完善,取得了突飞猛进的发展,由于其具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点,被广泛应用于医学检测、药物疗效考核、基因表达研究、转基因研究、基因检测、病原体检测、动植物检测、食品检测等各种领域。

市面上常见的几款荧光PCR机型。

 

 

市场主流荧光PCR机型



荧光实时定量PCR定量原理:

PCR每进行1个循环,DNA2倍的指数关系增长,不久达到平台期。起始DNA量越多扩增产物量便越早达到检出值,也就是扩增曲线越早起峰。我们将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR,就会按照起始DNA量由多到少得顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模板的对数值之间存在的线性关系,就可以制作成下图标示的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同,检测未知样品CT值,并将其代人标准曲线,就可以求出未知浓度样品的起始模板量,这就是Real Time PCR的定量原理。

 

在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行, PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。


实时荧光扩增曲线图

 

PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线,而是S形曲线。这是因为随着PCR循环数的增加,DNA聚合酶的失活,dNTP和引物的枯竭,反应副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因,致使PCR并非一直呈指数扩增,而最终将进入平台期。

荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段, PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,因此应选择这个阶段进行定量分析。

 

重要概念的定义:

1.  什么是基线?

基线就是扩增曲线中的水平部分。


线性基线期为扩展最初的10~15个循环,此时,PCR反应处于起始阶段,扩增产物很少,所产生的荧光信号很低。

 

2. 什么是荧光阈值(Threshold)?

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍,即:Threshold = 10 SDcycle 3-15


3. 什么是CT值?

C代表Cyclet代表threshold

Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。有实验证明Ct值大小与样本中的原始拷贝数成反比关系。Ct值是实时荧光PCR的主要定量参数

 

 

 

4. Ct值与起始模板的关系?

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中纵坐标代表起始拷贝数的对数,横坐标代表Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。



 

 

荧光定量PCR标记检测类型:

1.       内掺式染: SYBR Green I

荧光嵌合法通常使用SYBR Green ISYBR Green I是一种能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。它与PCR合成的双链DNA结合,在激发光照射下产生荧光,荧光染料结合到双链DNA后荧光信号增加1000倍,通过荧光强度的检测,可以实时监测PCR扩增的产物量。


溶解曲线:

采用SYBR Green I荧光嵌合法检测时,可以通过融解曲线分析,确认PCR反应的特异性。溶解曲线分析是在PCR反应结束后,将PCR反应液的温度渐渐升高,实时监测SYBR Green I的荧光信号强度变化进行的。起初由于PCR扩增产物呈双链,具有较高的荧光信号强度,随着温度的渐渐升高,DNA双链渐渐打开,嵌入DNA中的SYBR Green I数量减少,荧光信号强度就渐渐降低,当双链DNA解链一半时,荧光信号强度急剧下降,此时的温度即融解温度(Tm值),Tm值与PCR扩增产物的序列有关,对于某一PCR扩增产物,其值是固定的。





 如果出现两个或以上的峰型,说明有引物二聚体等非特异性扩增产生,需要对反应  条件进行优化或重新设计引物。

 

优点:成本较低,无须对引物或探针进行特殊的荧光标记,操作亦比较简单 ,适合于筛检。

缺点:特异性不够,染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中,使反应体系中的荧光本底较高




2.       序列特异性探针:

 

荧光共振能量转移(FRET):当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团(可以淬灭前者的发射光谱)的距离邻近至一定范围时,就会发生荧光能量转移,淬灭基因会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光,从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分开,淬灭作用即会消失。所以,利用核酸杂交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合或分开的原理,建立各种实时荧光PCR

a.       Taqman探针:

TaqMan Probe法是使用5’端带有荧光物质(如:FAM等),3’端带有淬灭物质(如:TAMRA等)的TaqMan探针进行荧光检测的方法。当探针完整时,5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约,不能检出荧光。而当TaqMan探针被分解后,5’端的荧光物质便会游离出来,发出荧光。

PCR反应液中加入荧光探针后,在PCR反应的退火过程中,荧光探针便会和模板杂交,进一步在PCR反应的延伸过程中,DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针,游离荧光物质发出荧光,通过检测反应体系中的荧光强度,可以达到检测PCR产物扩增量的目的,具体原理如下图:


 

 

b.       TaqMan MGB 探针:

能分辨一个碱基的差别。


 

 


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